骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征的中老年常见骨骼疾病，髋部骨折患者术后1年生存率仅为80%[1]，其发病机制主要涉及骨代谢平衡失调，表现为破骨细胞骨吸收活性增强和/或成骨细胞骨形成功能减弱，最终导致骨形成-吸收偶联失衡和骨微结构损伤[2-3]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作为具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，不仅是成骨细胞和骨细胞的主要前体来源，更是维持骨组织稳态的关键细胞群体[4]。近年研究[5-6]发现：BMSCs的谱系定向分化紊乱，特别是向脂肪细胞而非成骨细胞分化，是OP的重要病理基础，而年龄相关的BMSCs功能衰退则是老年性OP发生和发展的核心环节。
微RNA(microRNA，miR)在中医药调控BMSCs成骨分化过程中扮演关键调控角色[7]。其中，miR-21作为重要的骨代谢调节因子，在骨质疏松状态下呈显著低表达特征，其表达上调可有效改善骨代谢异常[8-9]。研究[10]表明：在OP动物模型中，miR-21通过特异性靶向S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase-associated protein2，Skp2)基因抑制破骨细胞生成，展现出潜在的治疗价值。开发miR-21纳米递送系统可通过增强BMSCs的成骨分化能力促进骨质疏松性骨折修复[11]。值得注意的是，骨质疏松状态下BMSCs内miR-21表达水平明显下调，而通过外源性手段恢复miR-21的表达可显著促进成骨分化进程[12]。Notch信号通路作为骨组织发育和稳态维持的关键调控网络，其成员Notch2具有抑制细胞增殖和分化的作用[13-14]。生物信息学预测分析发现，miR-21与Notch2存在特异性结合位点，提示miR-21可能通过负向调控Notch2表达来促进BMSCs成骨分化，进而影响OP的病理进程。
基于中医“肾藏精，主骨生髓”的理论基础，肾精亏虚可导致骨髓失养、骨量减少，最终引发OP[15]。BMSCs作为骨髓微环境的核心功能单元，其生物学特性与中医“肾精”功能高度契合，成为中医药防治OP的重要作用靶点。中医药以其独特的优势在治疗骨科疾病中发挥重要作用。黄芪作为临床治疗OP的常用中药，其活性成分黄芪皂苷IV(astragaloside IV，A-IV)属于环烷型三萜糖苷类化合物，具有促进干细胞增殖和分化的药理活性[16-17]。临床研究[18]显示含黄芪的中药复方可显著提升OP患者的骨密度并改善临床症状。与此同时A-IV可以抑制破骨细胞的形成，并与加压力学模型结合促进前成骨细胞株OCT-1的成骨分化[19]。然而，A-IV调控OP来源的BMSCs成骨分化的具体分子机制尚未完全阐明，有待深入揭示。本研究旨在探讨A-IV对OP大鼠BMSCs增殖与成骨分化的影响，并通过分析miR-21与Notch2的表达变化，深入阐明其分子机制。
材料与方法
伦理声明
本研究已获得湖南中医药大学第二附属医院动物伦理委员会批准(审批号：MDL2022-10-14-02)。
方法
大鼠OP模型的构建
成熟雌性SD大鼠经1周适应性喂养后，随机分为假手术(Sham)组(n=4)和卵巢切除术(ovariectomy，OVX)组(n=8)。手术器械经高压蒸汽灭菌进行无菌操作。采用OVX建立SD雌性大鼠OP模型，OVX组大鼠腹腔注射2.5%戊巴比妥钠(2 mL/kg)麻醉，于卵巢下方约0.5 cm处结扎并离断卵巢血管及输卵管，完整摘除双侧卵巢。Sham组大鼠仅切开腹腔暴露卵巢，并在卵巢周围切除等体积脂肪组织。术中用生理盐水冲洗创面，并局部应用适量青霉素预防感染，随后还纳腹腔脏器，逐层间断缝合肌层及皮肤。术后常规饲养12周，检测显示OVX组血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平显著高于Sham组，证实OP模型构建成功。每组随机选取4只大鼠，无菌条件下分离股骨用于BMSCs提取。
大鼠股骨BMSCs的分离、培养及成骨诱导分化与干预
无菌条件下分离双侧后肢股骨，彻底去除附着肌肉及软组织，暴露完整骨组织。用手术钳固定股骨，切除一端骨骺以开放骨髓腔，使用含15%胎牛血清(fetal calf serum，FBS)的α型最低必需培养基(alpha-minimum essential medium，α-MEM)冲洗骨髓腔，直至骨腔呈灰白色，收集冲洗液至离心管。以5 000 r/min离心5 min后弃上清，沉淀重悬于10 mL完全培养基，接种于培养瓶并置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。
原代培养期间，每3 d半量更换新鲜培养基，定期观察细胞形态及贴壁情况。待细胞融合为80%~90%时，以0.25%胰酶消化传代，持续培养至第3代。采用流式细胞术鉴定BMSCs的细胞表面间充质干细胞标志物CD29和造血干细胞标志物CD34的表达水平(CD29+/CD34-)，确认间充质干细胞特性。
将传至第3代的BMSCs随机分为3组。假手术(sham BMSCs，S-BMSCs)组：收集Sham组大鼠股骨髓腔内BMSCs，使用成骨诱导培养基(PD-008，pricella)诱导其成骨分化；OP模型OVX(ovariectomy BMSCs，O-BMSCs)组：使用成骨诱导培养基诱导OVX组大鼠股骨髓腔BMSCs成骨分化；A-IV干预(A-IV BMSCs，A-BMSCs)组：OVX组大鼠股骨髓腔BMSCs添加A-IV(MCE公司，No：84687-43-4)进行干预后，使用成骨诱导培养基诱导成骨分化；3组细胞均于相同条件下培养，定期检测成骨分化标志物，并进行组间比较。
细胞活性检测
将各组BMSCs以5×10³/孔的密度接种于96孔板，分别给予不同浓度A-IV(0、10、20、40、80 μg/mL)处理，每个浓度设3个复孔。培养至预定时间后，每孔加入四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)溶液[5 mg/mL，生工生物工程(上海)股份有限公司，E606334]，于37 ℃、5% CO2条件下继续孵育4 h。小心吸弃上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解甲臜结晶，37 ℃振荡10 min使结晶充分溶解。使用酶标仪在490 nm波长处检测各孔吸光度值，每组重复测定3次取平均值。
ALP活性检测
取成骨诱导7 d的各组BMSCs，经超声破碎制备样本。96孔板设置如下：空白孔(仅反应缓冲液)、标准孔(含已知浓度标准品)及样本测定孔(分别加入3组细胞裂解液)。参照ALP检测试剂盒(上海碧云天生物技术股份有限公司，P0321M)说明书配制反应体系，各孔加入等体积反应工作液。37 ℃避光反应30 min后，使用酶标仪于405 nm波长下测定吸光度值。通过标准曲线计算各组ALP活性，每组样本重复测定3次。
茜素红染色
成骨诱导21 d后，收集各组BMSCs。采用4%多聚甲醛溶液室温固定30 min，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)漂洗3次后，加入1%茜素红染色液(上海碧云天生物技术有限公司，C0148S，pH 4.2)室温避光染色20 min。光学显微镜下观察钙盐沉积形成的橙红色矿化结节。采用ImageJ软件定量分析钙化结节面积。
实时反转录聚合酶链反应
收集各组BMSCs，采用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取总RNA。使用Nanodrop，Thermo Fisher Scientific测定RNA浓度及纯度(A260/A280比值1.8~2.0)，取1 μg RNA经反转录试剂盒(美国Fermentas公司)合成互补DNA(complementary DNA，cDNA)，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表1)。实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription PCR，real-time RT-PCR)采用SYBR Green法。反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每个样本设3个技术重复，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)或U6为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。
| 引物名称 | 方向 | 序列(5'-3') |
|---|---|---|
| miR-21 | 正向 | TAGCTTATCAGACTGATGTTGA |
| 反向 | GCGAGCACAGAATTAATACGAC | |
| U6 | 正向 | CTCGCTTCGGCAGCACA |
| 反向 | AACGCTTCACGAATTTGCGT | |
| Runx2 | 正向 | TTCACCTTGACCATAACCGTC |
| 反向 | GGCGGTCAGAGAACAAACTAG | |
| OPN | 正向 | CTGACAAAGCCTTCATGTCCAA |
| 反向 | GCGGGCGAGTCTGTTCACTA | |
| Notch2 | 正向 | TGGAGGCAGGAGGAAAGAC |
| 反向 | GATGGGGCAAAGGTCAGTAGG | |
| GAPDH | 正向 | GTCGGTGTGAACGGATTTG |
| 反向 | TCCCATTCTCAGCCTTGAC |
蛋白质印迹法
采用RIPA裂解缓冲液(含1×蛋白酶抑制剂cocktail，美国Thermo Fisher Scientific公司)裂解各组BMSCs，于4 ℃ 下12 000 g离心15 min，收集上清。采用二喹啉甲酸(bicin-choninic acid，BCA)蛋白质定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司，P0012)测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)标准品制作标准曲线(0~2 000 μg/mL)；配制SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜，5% BSA[含吐温20的Tris缓冲盐溶液(Tris buffered saline with Tween 20，TBST)配制]室温封闭1 h，加入一抗于4 ℃孵育过夜，用TBST洗膜3次，每次10 min，于室温下孵育辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记二抗(1꞉5 000稀释)1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。用增强型化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂处理膜，并在暗室中用X光胶片显影。通过上述步骤，使用蛋白质印迹法检测并分析细胞中矮小相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)和Notch2等蛋白质的表达情况。
双荧光素酶实验
通过TargetScan数据库预测miR-21a-5p(miR-21)潜在靶基因Notch2，采用荧光素酶报告基因实验进行靶向关系验证；具体步骤将Notch2受体3'非翻译区(3' untranslated region，3'UTR)的预测结合序列(5'- AGAGTC…AAGAAATAAGCTAACTTG…TGTCAA-3')[生工生物工程(上海)股份有限公司]克隆至pMIR-REPORT载体的SpeI和HindIII酶切位点，并设计器突变体，与100 mol/L pre-miR-21-5p及0.2 μg β-半乳糖苷酶对照质粒共转染HEK293细胞，转染24 h后检测荧光素酶活性(经β-半乳糖苷酶标准化)。实验使用Lipofectamine 2000(美国Thermo Fisher Scientific公司)转染试剂进行细胞转染。
统计学处理
采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析。计量资料经Shapiro-Wilk检验验证正态性：符合正态分布的数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齐时选用LSD法进行两两比较，方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。所有实验均独立重复3次以上，P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
大鼠股骨来源的BMSCs表型鉴定
流式细胞术结果显示：S-BMSCs组和O-BMSCs组细胞的CD29表达率分别为89.7%和93.2%，均呈阳性表达；S-BMSCs组和O-BMSCs组细胞的CD34表达率分别为4.39%和3.74%，均呈阴性表达(图1)。这说明进行去势处理后提取的股骨来源的BMSCs仍然符合BMSCs的细胞表面标志物特征。
A-IV对BMSCs细胞增殖的影响
MTT法检测结果显示：与O-BMSCs组(0 μg/mL)比较，S-BMSCs组(0 μg/mL)在各时间点(1、3、5、 7 d)的增殖能力差异均无统计学意义(P>0.05)；当 A-IV浓度在10~80 μg/mL范围内时，A-BMSCs组的细胞增殖能力均显著高于O-BMSCs组(均P<0.05，图2)。这表明A-IV对OP大鼠BMSCs的增殖具有显著促进作用，且在10~40 μg/mL浓度范围内呈现明显的剂量依赖性增强效应。基于此，本研究确定40 μg/mL为A-IV促进BMSCs增殖的最佳干预浓度，并进行后续实验。
A-IV对BMSCs成骨分化的影响
ALP活性检测(图3)和茜素红染色(图4)评估A-IV对BMSCs成骨分化的影响的结果显示：与S-BMSCs组比较，O-BMSCs组的ALP活性显著降低(P<0.05)，钙化结节稀疏、数量明显减少。这表明OP显著抑制BMSCs的成骨分化能力。与O-BMSCs组比较， A-BMSCs组ALP活性显著提升(P<0.05)，钙化结节分布均匀，数量也明显增加，提示A-IV干预能有效促进OP来源BMSCs的成骨分化，恢复其矿化能力。综上，A-IV可通过增强BMSCs的成骨分化功能来改善OP。
A-IV对BMSCs成骨相关因子表达的影响
Real-time RT-PCR(图5)和蛋白质印迹法(图6)检测结果显示：与S-BMSCs组比较，O-BMSCs组Runx2和OPN的mRNA和蛋白质表达水平均显著降低(均P<0.05)。经A-IV干预后，A-BMSCs组细胞的Runx2和OPN的mRNA和蛋白质表达水平较O-BMSCs组均显著上调(均P<0.05)。这表明A-IV可通过上调成骨关键调控因子Runx2和OPN的表达，提升OP大鼠来源BMSCs的成骨分化能力。Runx2作为成骨分化的核心转录因子，其表达上调可进一步激活下游成骨相关基因的表达；而OPN作为重要的骨基质蛋白，其表达增加有助于促进细胞外基质的矿化，因此A-IV可能通过调控Runx2、OPN来改善OP导致的BMSCs成骨分化功能障碍。
A-IV通过调控 miR-21抑制Notch2影响BMSCs成骨分化
荧光素酶报告基因实验证实：miR-21与Notch2存在直接靶向调控关系，miR-21可特异性结合Notch2的3'UTR，显著抑制荧光素酶活性(图7A)。为阐明A-IV的作用机制，本研究检测各组BMSCs中 miR-21和Notch2的表达变化(以U6和GAPDH作为内参)，结果显示：与S-BMSCs组比较，O-BMSCs组的miR-21表达显著下调，同时Notch2的mRNA和蛋白质表达水平均显著上调(均P<0.05)；而经A-IV干预后，A-BMSCs组miR-21表达明显回升，Notch2的表达则被显著抑制(均P<0.05；图7B、7C)。上述结果提示，A-IV可能通过上调miR-21表达来抑制Notch2，从而促进BMSCs的成骨分化。
讨 论
随着年龄增长，人体骨骼系统逐渐出现退行性改变，其中OP已成为威胁中老年人健康的重要疾病[20]。该疾病以骨量显著减少、骨微结构破坏为特征，导致骨骼脆性增加和骨折风险升高[21]。目前，OP的治疗策略主要聚焦于维持骨代谢平衡和抑制骨吸收。然而，促进骨形成的药物研发面临挑战。这主要是因为骨形成过程极为复杂，涉及多种细胞和分子之间的相互作用与影响。骨形成的关键在于增加成骨细胞的数量，而这些细胞主要由BMSCs分化而来。
BMSCs是具有多向分化潜能的成体干细胞，在骨代谢平衡中发挥关键调控作用[22-23]。生理状态下，BMSCs可定向分化为成骨细胞促进骨形成，而病理条件下则异常分化为脂肪细胞，导致骨髓脂肪堆积和骨形成减少，这正是OP的典型病理特征[24]。随着年龄增长，BMSCs表现出数量减少、成骨分化能力下降及成脂倾向增强等衰老特征，这种“成骨-成脂”分化失衡成为OP发病的重要机制[25]。这一现代医学发现与传统中医“肾主骨”理论高度契合：肾精的盛衰变化类比于BMSCs的增殖分化能力，“精生髓、髓养骨”的经典论述恰反映了BMSCs通过成骨分化维持骨稳态的生物学过程。因此，通过靶向调控BMSCs的定向分化来纠正“成骨-成脂”失衡，已成为OP再生治疗的重要策略方向。
黄芪皂苷是中药黄芪的核心活性成分及定性定量指标[26]，其化学结构为羊毛甾醇型四环三萜皂苷(分子式为C41H68O14)，近年研究[27]发现该成分具有免疫调节、心脑血管保护、抗肿瘤及器官保护等多重药理活性。鉴于过去20年间黄芪因其作为补益药物在中药治疗OP中的高频使用，结合黄芪皂苷的多种药理活性，笔者推测黄芪皂苷可能在OP的预防和治疗中发挥重要作用。本研究探讨了A-IV对去势大鼠来源BMSCs增殖的影响。MTT实验表明：A-IV在10~80 μg/mL浓度范围内能显著促进BMSCs增殖，其中10~40 μg/mL呈现明显的剂量依赖性增强效应，并在40 μg/mL时达到最佳促增殖效果。这一发现不仅证实了A-IV对BMSCs的正向调控作用，同时为后续研究确定了40 μg/mL这一优化干预浓度。
ALP活性和钙化结节形成是评估BMSCs成骨分化进程的关键指标[28]。在成骨分化过程中，Runx2作为核心转录调控因子，具有双重功能：一方面在分化起始阶段促进间充质干细胞向成骨细胞定向分化；另一方面在分化后期抑制成熟成骨细胞的增殖，调控其向骨细胞的分化进程[29]。OPN作为重要的分泌型磷蛋白，不仅参与细胞外基质的矿化调控，还在破骨细胞与成骨细胞的相互作用中发挥关键调节作用[30]。
Wang等[31]学者发现，A-IV作用于BMSCs后，ALP水平显著提升，证明其与成骨相关。本研究发现：卵巢去势大鼠来源的BMSCs表现出显著的成骨分化障碍，具体表现为ALP活性降低和钙化结节数量减少；经A-IV干预后，A-BMSCs组的成骨分化能力明显改善，ALP活性增加，矿化面积增加，同时成骨相关基因(Runx2、OPN)表达显著上调。这提示A-IV显著提升OP大鼠股骨来源BMSCs成骨分化能力。Wu等[32]的研究表明A-IV能显著促进大鼠BMSCs的增殖并诱导其向成骨细胞分化。值得注意的是，这一促分化作用在加入miR-21抑制剂后显著减弱，提示A-IV的成骨诱导效应可能通过调控 miR-21的表达来实现。
MiR-21是一种长度为21~25个核苷酸的非编码小RNA，通过调控靶mRNA的翻译或降解来影响细胞的增殖与分化过程。Meng等[33]的研究进一步证实miR-21在成骨分化中的关键作用：在人脐带间充质干细胞中，过表达miR-21可显著上调成骨相关基因的表达水平，而miR-21抑制剂则能逆转这一效应。这些发现均表明miR-21可能是调控间充质干细胞向成骨细胞分化的关键分子之一。
Notch信号通路在胚胎发育及骨稳态维持中发挥关键调控作用。Notch2的功能获得性突变与哈杰杜-切尼综合征(Hajdu-Cheney syndrome，HCS)密切相关，该疾病以早发性OP为主要特征[34]。Yorgan等[35]进一步证实，Notch2通过抑制成骨细胞分化参与骨重塑调控，但其持续表达导致OP的具体机制尚不明确。基于Targetscan数据库预测分析显示Notch2 mRNA的3'UTR区存在miR-21的潜在结合位点，提示miR-21可能通过靶向Notch2影响BMSCs的成骨分化进程。本研究进一步采用荧光素酶实验证实了miR-21与Notch2的靶向结合关系，进一步采用蛋白质印迹法和real-time RT-PCR技术检测了不同干预条件下BMSCs的miR-21、Notch2及成骨相关因子OPN和Runx2的相对表达水平。相较于Sham组，OVX组的BMSCs在成骨诱导后miR-21表达显著下调，同时Notch2的mRNA及蛋白质水平明显升高，而OPN和Runx2的表达则显著降低。A-IV处理可显著上调miR-21及成骨相关因子(OPN、Runx2)的表达，同时抑制Notch2的转录和翻译。这表明A-IV可通过上调miR-21的表达水平，特异性抑制Notch2信号通路的激活，从而有效促进BMSCs的成骨分化。这一发现不仅揭示了OP发病的新机制，也为阐释黄芪皂苷的骨保护作用提供了重要的分子理论基础。
综上所述，A-IV通过miR-21/Notch2信号轴显著增强卵巢去势大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力。这一作用机制提示A-IV在防治OP方面具有明确的治疗潜力，将为黄芪皂苷的临床转化应用提供更充分的科学依据。
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