光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)由于创伤微小、选择性高、很少出现耐药，因此受到越来越多的关注[1]。光敏剂是PDT中影响疗效的主要因素。PDT中应用的光敏剂分为电子转移型(I型)和能量转移型(II型)2类。I型光敏剂具有低氧依赖的优点，在肿瘤的PDT中成为优选，尤其是在实体瘤治疗中(实体瘤中往往存在缺氧环境)[2]。然而，目前报道的I型光敏剂由于水溶性差、发射波长短，在临床应用中受到一定的限制[3]。近年来，具有聚集诱导发光(aggregation-induced emission photosensitizer，AIE)特性的I型光敏剂因其在聚集状态下发射荧光强、斯托克斯位移(Stokes shift)大、光稳定性好等优点成为PDT中光敏剂的理想选择。本课题组前期利用生物相容性大分子聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)对离子型I型光敏剂进行聚集诱导近红外红色荧光修饰，制备了一种具有AIE特性的新型水溶性光敏剂PEG-MTPABZ-PyC，具体分子结构见图1[4]。与传统光敏剂相比，这种新型光敏剂除了具备上述AIE类光敏剂的优点外，还有2大优势：一是具有显著的水溶性(37 µg/mL)，在水溶液中最大荧光波长在670 nm处；二是具有较好的红色荧光标记性能。作为具有AIE特性的I型光敏剂，其在缺氧的实体肿瘤胃癌中具有一定的应用优势，因此本研究验证其杀伤胃癌细胞的疗效，旨在为这种新型光敏剂在胃癌PDT中的应用积累实验数据，奠定其应用基础。
材料与方法
材料及仪器
本研究所用胃癌细胞株MKN45由成都中医药大学附属医院检验科保存。Dulbecco的改良Eagle培养基 (Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM)、胎牛血清及0.25%胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8，CCK-8)、膜联蛋白V(Annexin-V)/碘化丙啶(propidium lodide，PI)双染凋亡检测试剂均购自北京索莱宝生物技术有限公司；2’-7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯(2’-7’- dichlorodihydrofluo-rescein diacetate，DCFH-DA)荧光探针购自南京建成生物工程研究所；检测设备高内涵活细胞成像系统(型号为Operetta CLS)购自美国铂金埃尔默公司；多功能连续光谱分析仪(型号为3001)购自美国赛默飞公司；倒置荧光显微镜(型号为IX53)购自日本奥林巴斯公司；流式细胞仪购自美国BD公司(Becton, Dickinson and Company；型号：BD FACSCanto)。
方法
细胞培养
胃癌细胞株MKN45采用含10%胎牛血清的DMEM置于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养，细胞传至第3代，融合度达80%左右时进行下一步实验。
检测PEG-MTPABZ-PyC进入细胞的时间
将20 μmol/mL的PEG-MTPABZ-PyC加入MKN45细胞培养体系后，对MKN45细胞核进行Hoechest染色，培养体系中加入红色荧光PEG-MTPABZ-PyC，利用高内涵活细胞成像系统实时动态监测光敏剂PEG-MTPABZ-PyC进入MKN45细胞的时间，由于光敏剂发红色荧光，在细胞中可以精确定位，高内涵活细胞系统能够精确检测光敏剂进入胃癌细胞MKN45的时间。
检测PEG-MTPABZ-PyC进入细胞后在细胞中的定位
为了检测PEG-MTPABZ-PyC进入细胞后的定位，预先对溶酶体进行荧光标记(绿色荧光)，将光敏剂PEG-MTPABZ-PyC(20 μmol/mL)加入胃癌细胞MKN45培养体系后利用高内涵活细胞成像系统实时动态监测光敏剂进入细胞后在细胞中的定位。
检测PDT中PEG-MTPABZ-PyC对胃癌细胞株MKN45的杀伤效果
采用CCK-8和双染凋亡检测法研究不同干预方案对胃癌细胞MKN45的杀伤效果。
CCK-8检测法：在96孔板以5 000个/孔细胞密度接种MKN45细胞，待细胞生长至80%时按上述分组干预：1)PEG-MTPABZ-PyC+PDT组，加入 20 μmol/mL PEG-MTPABZ-PyC光敏剂后利用650 nm红外光波仪对共培养体系光照治疗20 min(光照强度功率密度为80 mW/cm2，能量密度为100 J/cm2，光照范围为皮损周围0.5 cm)；2)喜泊酚+PDT组，加入 20 μmol/mL临床常用光敏剂喜泊酚后对共培养体系光照治疗20 min(光照强度功率密度为80 mW/cm2，能量密度为100 J/cm2，光照范围为皮损周围0.5 cm)；3)单纯PEG-MTPABZ-PyC组，仅加入20 μmol/mL PEG-MTPABZ- PyC光敏剂；4)对照组(生理盐水对照)，仅加入20 μL生理盐水。各组干预结束后每孔加入10 μL CCK-8检测试剂，继续培养1 h后利用酶标仪检测波长450 nm处的吸光度，利用以下公式计算活细胞率：活细胞率=(实验组平均吸光度值÷对照组平均吸光度值)×100%。根据活细胞率和原来接种的细胞数量计算活细胞数。每组重复3次。
Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测法：按上述实验分组干预48 h后，用胰蛋白酶消化后收集细胞，磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次，1×106个细胞重悬于100 μL 1×结合缓冲液中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI(避光操作)，室温避光孵育15 min后加入400 μL 结合缓冲液中混匀，立即用流式细胞仪检测。
检测各组ROS产生情况
为了明确新型光敏剂应用PDT杀伤胃癌细胞的机制，利用DCFH-DA标记法检测各组干预后细胞活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生情况。具体方法为：各组处理前，先用1 mmol/L ROS清除剂NAC预处理细胞1 h，用PBS冲洗2次。之后按上述分组干预后弃去培养基，随后加入不含血清的DMEM(含10 μmol/L DCFH-DA荧光探针)，避光孵育1 h。最后通过荧光显微镜观察荧光强度。
统计学处理
采用GraphPad Prism 10.0软件分析数据。计量资料以均数±标准差表示，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)和Student t检验进行比较，P<0.05为差异具有统计学意义。
结 果
PEG-MTPABZ-PyC进入细胞的时间
经高内涵活细胞成像系统不间断监测，结果显示：在加入PEG-MTPABZ-PyC 6 h后，PEG-MTPABZ-PyC明显进入了胃癌细胞中，具有较高的荧光强度且稳定(图2)。
PEG-MTPABZ-PyC在细胞内的定位
如图3所示，经高内涵活细胞系统检测，新型光敏剂PEG-MTPABZ-PyC进入细胞后定位于溶酶体细胞器。对溶酶体细胞器进行绿色荧光染色后，加入红色PEG-MTPABZ-PyC光敏剂，结果显示光敏剂进入细胞后定位于溶酶体，与溶酶体荧光重合。
PEG-MTPABZ-PyC对胃癌细胞株MKN45的 杀伤能力
CCK-8法检测结果显示：PEG-MTPABZ-PyC+PDT组细胞死亡率与对照组及单纯PEG-MTPABZ-PyC组相比显著升高(均P<0.05)；PEG-MTPABZ-PyC+PDT组细胞死亡率与喜泊酚+PDT组相比也显著升高(P<0.05)，而单纯PEG-MTPABZ-PyC组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05，图4)。双染凋亡检测的结果与CCK-8法检测结果相同。
PEG-MTPABZ-PyC杀伤胃癌细胞的机制
DCFH-DA标记法检测结果显示：PEG-MTPABZ-PyC+PDT组绿色荧光表达最高，喜泊酚+PDT组也产生ROS，但是产量少于PEG-MTPABZ-PyC+PDT组，而单纯PEG-MTPABZ-PyC组和对照组无ROS产生(图5)。
讨 论
PDT具有微创、高选择性和无耐药性等优势，在实体瘤治疗领域引发广泛的关注[5]。实体肿瘤(如胃癌)具有典型的缺氧环境。肿瘤缺氧是由肿瘤细胞的异常增殖和肿瘤血管畸形引起的，在缺氧的环境中光敏剂产生ROS的效率降低，因此缺氧环境会严重影响PDT的效果[6]。解决上述问题的思路有2种：一是利用高压氧、二氧化锰、过氧化氢等氧自补材料或其他途径为缺氧的实体瘤内部补充氧以激发光敏剂的活性；二是开发具有低氧依赖性的新型光敏剂[7]。因此，近年来具有低氧依赖性的新型光敏剂研发成为一个研究热点。
I型光敏剂更具开发为低氧依赖型光敏剂的潜力[8]。Xiong等[9]设计并制备了一系列适应低氧环境的I型光敏剂，能很好地抑制肿瘤生长，但荧光自吸收和光漂白作用明显，不利于细胞和肿瘤的长期荧光成像。相比于传统的商业光敏剂(如卟啉、亚甲基蓝衍生物等)，其在荧光成像时间、荧光强度及产生ROS的效率方面有明显优势，对细胞和肿瘤的长期荧光成像非常有利[10-11]。文献[12-15]报道了一系列具有AIE活性的I型光敏剂，其荧光颜色从黄色到近红外不等，在荧光成像和癌症治疗方面表现出较高效率。然而，这类光敏剂由于多芳环结构而具有较强疏水性，限制了其在实际中的应用[16]。
为了改善AIE类光敏剂的亲水性，本课题组采用生物相容性大分子PEG对AIE类光敏剂MTPABZ-PyC进行修饰，合成水溶性更好的光敏剂PEG-MTPABZ-PyC，其可以更高效地生成ROS，PEG化后的PEG-MTPABZ-PyC具有较好的水溶性，在PBS中的饱和浓度达到37 µg/mL，结果显示：在6 h时光敏剂全部进入MKN45细胞内部，稳定地定位于细胞溶酶体，应用PDT后能够有效杀死MKN45细胞，并在细胞内产生ROS。这表明此新型光敏剂经光照后在细胞内产生大量ROS，对细胞造成氧化损伤，符合AIE类光敏剂的PDT杀伤机制。这种新型光敏剂有望在治疗实体肿瘤方面发挥重要作用。
目前研究改善AIE类光敏剂亲水作用主要聚集在2个方面：一方面是用极性离子基团修饰AIE类光敏剂的活性以改善亲水性[17]，缺点是存在潜在的生物毒性并且难以纯化；另一方面是通过脂质体和蛋白质等亲水性聚合物获得纳米颗粒，封闭AIE类光敏剂的疏水基团，缺点是体内循环不稳定、重现性差和药物释放不可控[18-19]。新型光敏剂PEG-MTPABZ-PyC的研发提供了化学修饰的新思路，为改善AIE类光敏剂的亲水性奠定了一定的实验基础。
Advances in medicine: photodynamic therapy
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